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植物抗污染分化進(jìn)化研究進(jìn)展及其分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用
長(zhǎng)期以來(lái)人們憑借形態(tài)特征和數(shù)量變化來(lái)進(jìn)行植物抗污染生態(tài)分化研究，但對(duì)許多深入的研究卻無(wú)能為力。目前，分子生物學(xué)技術(shù)日趨成熟并已大量運(yùn)用于污染進(jìn)化生態(tài)學(xué)研究中。這些技術(shù)的引入為傳統(tǒng)分化進(jìn)化研究打開(kāi)了新局面，為進(jìn)一步從本質(zhì)上揭示污染條件下植物進(jìn)化提供了可能。只有將分子生物學(xué)技術(shù)引入植物抗性進(jìn)化研究中，將宏觀與微觀結(jié)合起來(lái)我們才有可能使許多問(wèn)題得以解決[19]。同工酶、等位酶電泳技術(shù)的完善，作為第一代分子生物學(xué)標(biāo)記的RFLP技術(shù)，以及近年來(lái)PCR技術(shù)的成熟和RAPD技術(shù)在國(guó)內(nèi)外迅速發(fā)展，為實(shí)現(xiàn)上述研究提供了迅捷可靠的工具。
2.1 同工酶電泳技術(shù)
同工酶作為基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)的多樣性在一定程度上反映出不同種群在不同污染歷史條件下分化進(jìn)化上DNA組成和生物體遺傳多樣性。同工酶之所以作為分化進(jìn)化的重要研究對(duì)象，首先是因?yàn)樗谄贩N間有豐富的多樣性。目前一半以上的酶類存在同工酶類。其次，同工酶易于檢測(cè)出。同工酶雖然由單拷貝基因編碼，但通過(guò)酶染色放大作用同樣易于檢測(cè)出。
等位酶作為一種特殊形式的同工酶，它由一個(gè)基因位點(diǎn)、不同等位基因編碼。根據(jù)等位酶譜帶的遺傳分析確定出每種等位基因在居群中的頻率，從而計(jì)算出它們的遺傳相似度或遺傳距離，再根據(jù)遺傳距離分析植物對(duì)污染的適應(yīng)過(guò)程中遺傳結(jié)構(gòu)變化，依據(jù)分子鐘進(jìn)化理論計(jì)算出遺傳進(jìn)化的理論時(shí)間，從而評(píng)估污染對(duì)植物進(jìn)化影響的速度和強(qiáng)度[8、14]。目前的研究結(jié)果表明，經(jīng)歷污染時(shí)間越長(zhǎng)，居群間的遺傳相似系數(shù)就越小[5,14,21]
Mejnartowicz[24]利用同工酶技術(shù)發(fā)現(xiàn)受氟化物、SO2污染的蘇格蘭松F1代某些基因和基因型大為減少，Muller-Starck等[22]利用同工酶技術(shù)研究表明歐洲山毛櫸同工酶平均每個(gè)位點(diǎn)基因數(shù)目隨污染而下降，Scholz等[23]檢測(cè)了挪威云杉對(duì)SO2敏感性各不相同的一系列無(wú)性系的若干同工酶位點(diǎn)，也證明一定量的遺傳信息有因污染而喪失的危險(xiǎn)性[20-22]。但是，由于種群雜合性影響，某些同工酶分析顯示了相互矛盾的結(jié)果， 這表明同工酶技術(shù)所揭示的與污染脅迫的植物遺傳變異的復(fù)雜性[3、15、21、25]。
2.2 RFLP技術(shù)
RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphisma,限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性)作為第一代分子生物學(xué)標(biāo)記自問(wèn)世以來(lái)已廣泛運(yùn)用于多門生物學(xué)科研究中，但它運(yùn)用于植物抗性研究還只是近幾年的事。RFLP能對(duì)植物的抗性基因進(jìn)行定位和分離，利用RFLP技術(shù)，對(duì)于核基因組或葉綠體基因組、尤其是后者，若能提取純凈DNA，則可直接從酶切后的電泳圖譜看出其多態(tài)性，利用這一方法可以測(cè)定種群內(nèi)、種群間不同水平的物種在污染環(huán)境下抗性分化進(jìn)化水平上的差異。
與核酸序列分析相比，RFLP可省去序列分析中許多非常繁瑣工序，但相對(duì)RAPD 而言，RFLP方法更費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，需要進(jìn)行DNA多種酶切、轉(zhuǎn)膜以及探針的制備等多個(gè)步驟，僅對(duì)基因組單拷貝序列進(jìn)行鑒定。但RFLP又有比RAPD優(yōu)越之處， 它可以用來(lái)測(cè)定多態(tài)性是由父本還是母本產(chǎn)生的，也可用來(lái)測(cè)定由多態(tài)性產(chǎn)生的突變類型究竟是由堿基突變或倒位、 還是由缺失、插入造成的[26]。
2.3 PCR技術(shù)
PCR(Ploymerase Chain Reactions,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))自80年代中期問(wèn)世以來(lái)，以其快速、簡(jiǎn)便、靈敏、特異等特點(diǎn)受到分子生物學(xué)界極大青睞，已廣泛用于基因工程、臨床檢驗(yàn)、環(huán)境生物監(jiān)測(cè)以及進(jìn)化生態(tài)學(xué)中核酸水平的基因多態(tài)性等研究領(lǐng)域。
PCR由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸三部反應(yīng)構(gòu)成一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，使目的DNA片段得以迅速擴(kuò)增。這一技術(shù)能選擇性富集一個(gè)特異DNA序列，并成106擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增技術(shù)與RFLP結(jié)合使用其用途更為廣泛，PCR技術(shù)主要優(yōu)點(diǎn)有：①PCR與DNA測(cè)序結(jié)合，擴(kuò)增后無(wú)需再克隆，純化即可直接測(cè)序。②可擴(kuò)增一個(gè)只知基因一側(cè)或兩側(cè)堿基序列的基因。 ③可進(jìn)行DNA多種突變的測(cè)定，如堿基互換、缺失、插入型突變[16]。PCR 近幾年已逐漸引入到植物抗污染進(jìn)化研究領(lǐng)域中，并表現(xiàn)出強(qiáng)大的應(yīng)用潛力。
2.4 RAPD技術(shù)
1990年Williams和Welsh等[27、28]運(yùn)用隨機(jī)擴(kuò)增尋找多態(tài)性DNA片段作為分子標(biāo)記， 并將此法命名為RAPD法(Random Amplified Polymorphism DNA,隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA) 。盡管RAPD技術(shù)誕生時(shí)間不長(zhǎng)，但由于其獨(dú)到的DNA 多態(tài)性及快速和比PCR更簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，使它成為基因組遺傳圖譜構(gòu)建；基因定位及進(jìn)化生態(tài)學(xué)研究中最為重要手段之一。
RAPD與PCR、RFLP、DNA指紋圖技術(shù)相比，它有如下特點(diǎn)：①RAPD 技術(shù)可在對(duì)受試物種缺乏任何分子生物學(xué)研究背景下，直接對(duì)基因組進(jìn)行多態(tài)性分析。②操作簡(jiǎn)單；一次 RAPD擴(kuò)增實(shí)際就是一次簡(jiǎn)單的PCR反應(yīng)，適合大量的樣本快速分析。③所需模板DNA量極少； 一般一次擴(kuò)增只需10-50ngDNA，這對(duì)于瀕危動(dòng)植物的基因組分析是十分有效的[27、29-31]。④與RFLP相比，RAPD可免去探針克隆與分離過(guò)程，不需進(jìn)行DNA序列分析。⑤RAPD同時(shí)適用于基因組的單拷貝區(qū)域或重復(fù)序列區(qū)。
RAPD在植物抗污染進(jìn)化研究中具有重大推動(dòng)作用。利用RAPD 分析礦區(qū)不同重金屬污染歷史下作物DNA結(jié)構(gòu)多樣性，從中可試圖找到對(duì)重金屬污染具有抗性的DNA片段或基因組。這些研究雖然在國(guó)內(nèi)外剛剛起步，但這些工作直接從分子水平上分析污染條件下種群遺傳結(jié)構(gòu)上的分化進(jìn)化，在理論上具有廣闊的研究前景和意義。
2.5 核酸序列測(cè)定
核酸序列測(cè)定包括DNA和RNA序列的測(cè)定。由于rRNA基因較保守，因此分子生物學(xué)中更重視r(shí)RNA基因的測(cè)定。在植物抗污染進(jìn)化研究中主要運(yùn)用葉綠體4.5SrRNA、5SrRNA 及胞質(zhì)5SrRNA基因，然而，核酸序列的測(cè)定在植物抗性分化進(jìn)化研究中尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)， 此項(xiàng)技術(shù)在實(shí)際操
作和運(yùn)用上還有待于進(jìn)一步完善。
3 結(jié)語(yǔ)
近二三十年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)迅速成熟為植物抗污染進(jìn)化研究提供了極為重要的研究工具和手段，為傳統(tǒng)的抗性研究打開(kāi)了新的局面。同時(shí)，植物抗性進(jìn)化研究為生態(tài)遺傳學(xué)、進(jìn)化生態(tài)學(xué)以及作物選擇育種提供了背景材料和研究窗口。目前，分子生物學(xué)技術(shù)在抗性進(jìn)化研究中的應(yīng)用剛剛起步，有待于深入和發(fā)展。與此同時(shí)，我們也應(yīng)清醒的認(rèn)識(shí)到微觀技術(shù)研究有其自身的局限性，因此我們應(yīng)站在宏觀進(jìn)化生態(tài)學(xué)高度在理論、方向上進(jìn)行指導(dǎo)，只有宏觀與微觀有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，植物抗性進(jìn)化研究才可能有更大的突破。
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